客戶通過(guò)CO-IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)A、B兩個(gè)蛋白有相互作用，想進(jìn)一步通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，其中A蛋白大小為45kDa，親水性較好，選用大腸桿菌系統(tǒng)獲得GST-A蛋白; B蛋白疏水性很強(qiáng)，且非常大(275kDa)，普健根據(jù)多年蛋白制備經(jīng)驗(yàn)，推薦客戶選擇用昆蟲(chóng)系統(tǒng)表達(dá)B蛋白(PS：昆蟲(chóng)桿狀病毒能容納大分子的插入片段，能包裝大的基因片段)

二、 B蛋白制備流程

　　1、 B蛋白分析：

　　B蛋白一共2511AAs，無(wú)信號(hào)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，疏水性很強(qiáng)，選取1-2511AAs為表達(dá)目的片段，C端添加6*his標(biāo)簽;

　　(1)信號(hào)肽分析結(jié)果：

　　(2)疏水性分析結(jié)果：

　　(3)跨膜區(qū)分析結(jié)果：

　　1、 基因優(yōu)化合成B蛋白，構(gòu)建pFast-bac1-B表達(dá)質(zhì)粒;

　　2、 藍(lán)白斑篩選方法獲得重組的Bacmid，經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性后，轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，獲得P1代病毒粒子，通過(guò)P1代表達(dá)測(cè)試，鑒定是否有目的蛋白表達(dá);

　　3、 生產(chǎn)P2代病毒粒子，進(jìn)行MOI測(cè)試，選最優(yōu)條件進(jìn)行200ml放大及純化，獲得目的蛋白;

三、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

　　圖1：P1代表達(dá)測(cè)試結(jié)果

A. 考馬斯亮藍(lán)染色. B. His 標(biāo)簽抗體WB鑒定蛋白 (ECL曝光).

　　圖2：P2代MOI測(cè)試結(jié)果

考馬斯亮藍(lán)染色

　　圖3：樣品純化后QC結(jié)果

A.考馬斯亮藍(lán)染色. B. His 標(biāo)簽抗體WB鑒定蛋白 (ECL曝光).

　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：

　　SDS-PAGE結(jié)果顯示260kDa左右有條帶，通過(guò)His 標(biāo)簽，WB檢測(cè)曝出與目的蛋白大小一致的條帶，說(shuō)明SDS-PAGE膠上的條帶為目的蛋白條帶，蛋白純度為90%。

　　蛋白表達(dá)量為：200ml可純化到1.8mg His-B蛋白

　　圖4：GST-A蛋白與HIS-B蛋白GST pull down實(shí)驗(yàn)結(jié)果

　　結(jié)論：GST-A蛋白與His-B蛋白是有相互作用的。

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